Chromosome study의 전 과정

[Chromosome study process]

세포 배양 → 세포 수확 → 슬라이드 염색 → 판독 의 과정으로 이루어진다.

 

1. Samples

   A. Sample 종류

Floating cells (short-term culture)	PB, BM	24~72 hrs
Attached cells (long-term culture)	AF, POC (Products of conception), skin fibroblast	1~4 weeks

   B. Container는 반드시!!! Na-heparin tube

        i. Mitotic index 가 가장 높음.

        ii. EDTA 는 Ca-chelating agent 이므로 cell cycle 을 위해 필수적인 Ca ion 을 소비함. 따라서 EDTA 는 금기.

 

2. Culture

   A. 플라스크(floating) 준비. (각 2개의 배양계가 원칙!)

   B. RPMI(+ ABx.) 배지 + NBCS (newborn calf serum) + mitogen + Sample

        i. Mitogen의 역할: 원하는 lineage 의 cell 의 배양을 촉진.

           ①. PB 에는 무조건 PHA (T-mitogen): T cell 의 수가 B cell 보다 많기 때문.

                (PB의 ~30% 정도가 lymphocyte / T cell 이 ~80%, B cell 이 15%, NK cell이 5% 정도.)

                (granulocyte 는? Maturation 이 끝나서 mitogen 에도 분열x. Lymphocyte 가 자극에 반응을 잘한다)

           ②. BM 은 impression 에 맞게: PHA(T), TPA(B), CLL(CpG)

        ii. Sample 의 양은? 세포 수 106/1ml 가 배양에 가장 적절한 밀도.

           ①. PB 에서는 보통 (1.5)ml 를 분주.

                Severe pancytopenia 환자의 경우, centrifuge 하여 buffy coat 층으로 분주하기도 함.

           ②. BM 은 sample quality 및 cellularity 가 제각각이므로, cell count 를 해서 sample 양 정함.

                Sample에 RBC lysis solution 넣고 WBC 카운트 한다. (by 뉴바우어 챔버)

   C. Incubation: 37도, 5% CO2 incubator 에서 배양.

         i. PB: 72hrs (Newborn 과 같이 stem cell 이 많은 검체의 경우 48h 이면 충분할 수 있다.)

         ii. BM: mitogen 에 알맞은 시간으로 배양. (mitogen 넣은 것은 72 hrs / no mitogen 은 24 hrs)

         iii. Long-term specimen: 6일 후 attach 정도 확인하고, 추가 배양 시행. (~ 4주)

 

3. Harvest; metaphase 의 cell 을 얻는 과정.

염색체 연장 →  유사분열 억제 → 저장액 처리 → 고정액 처리 → 슬라이드 제작

   A. EtBr: Resolution 높이기 위해 염색체 연장. (PB 에만! 550 resolution): BM 은 chromosome 손상됨.

        i. 1hr 더 incubation

   B. Colcemid: Spindle poison (방추사 형성 억제하여 metaphase 에 cell cycle arrest)

        i. (with mitogen) 30min / (without mitogen) 10min incubation

   C. Hypotonic solution: 0.075M KCL (세포 빵빵하게 해서 chromosome 넓게 퍼지게 하는 작용)

        i. 37도, 20분 동안 warming.

   D. Fixative: Carnoy’s solution (메탄올3 + glacial acetic acid1)

       염색질 단단하게 하여 염색체가 염색 잘 될 수 있도록 형태의 질을 향상 시킴.

        i. Prefixation; 한 번에 fixation 시키면 chromosome 손상될 수 있음.

        ii. Fixation & washing

   E. 슬라이드 제작 (온도/습도 매우 중요! For chromosome spreading)

        i. 높은 곳에서 슬라이드 위로 세포 부유액 떨어뜨림.

           물리적 충격으로 세포막이 터져 chromosome 이 슬라이드에 부착됨.

        ii. 슬라이드 뒷면에 습기 가하고 바로 warming (65도: BM /75도: PB)

        iii. 위상차 현미경으로 chromosome spreading 정도 확인: 가습 시간 늘려주면 spreading 이 더 잘 됨.

 

4. Stain: Trypsin (히스톤 단백질 lysis) + Giemsa stain (G-banding; A-T rich dark) + Phosphate buffer + Methanol

Cf) GTG banding이란? = G-bands by Trypsin using Giemsa stain의 약어로, G-banding과 같은 의미.

 

5. Reading

   A. PB: 최대한 정상인 metaphase 위주로 reading (550 resolution)

   B. BM: 비정상인 metaphase 위주로 reading (400 resolution)

   C. Resolution: 10 q21 이 1개로 보이면 400 / 2개로 보이면 550

   D. 20 metaphases 를 읽는 이유? Low-level mosaicism(4~10%) detect 하기 위해.

        i. Tunner syndrome 의 경우, 20개 읽어서 10% 이상의 확실한 mosaicism 이 확인되면 분석 마쳐도 되지만,

           1개에서만 다른 karyotype 확인되면 10개를 추가로 읽어서 총 30개를 분석해야 함. (by ACMG guideline)

   E. 2개 이상의 clone 이 있을 때, stemline 은 2개 이상의 karyogram 을, sideline 은 1개의 karyogram

       Cf) Stemline = sl = The most basic clone of a tumor cell population and is listed first

             Sideline = sdl = All additional clones deviating from the stemline

 

 

[Staining technique; 1~3, whole region; 4~6, specific region]

 

1. G-banding(m/c): Giemsa stain; A-T rich dark

정상 남성의 Karyogram입니다. G-banding.

2. Q-banding: Quinacrine stain(형광염료); A-T rich 에서 형광~

3. R-banding; Reverse of G-banding; G-C rich dark: G-C rich region 의 이상유무 확인.

4. C-banding; Centromere, heterochromatin 부위 염색 (1,9,16,Y chr)

5. NOR-banding; Silver stain; acrocentric의 stalk/satellite 부위 염색 (nucleolar organizing regions)

6. T-banding; Telomere 염색

7. High resolution banding technique: Thymidine 넣어서 prophase, prometaphase 까지 모두 획득, 고해상도 (> 850 resolution)