산전 염색체 검사

[산전 진단]

1.    산전 염색체 검사

출생 전 태아의 선천성 염색체 이상 여부를 알기 위해

(1) 양수 천자, (2) 융모막 생검, (3) 제대혈 천자 검체를 이용하여

세포 유전학적 방법으로 선천성 염색체 이상을 확인하는 것.

   A.     최소 15개 colony, 최소 20개 metaphase 카운트 및 분석 by 2 observers

   B.     문제점: 배양실패, Maternal cell contamination, Pseudomosaicism, CPM

 

2.    적응증

   A.     > 35 y 고령 산모

   B.     부모 중 염색체 이상; Balanced translocation carrier

   C.     선천성 기형 / 염색체 이상을 가진 아이를 임신한 과거력  

   D.     산전 검진 양성; 초음파 / 모체혈청검사 / NIPT 이상

   E.      유전질환 가족력

   F.      Wanted

 

3.    검체 채취 시기

   A. (10-13주) chorionic villi biopsy (융모막 생검) / 태아 손실률 1% (but, 조기 진단)

   B. (15-20주) Amniocentesis (양수천자) / 태아 손실률 0.5% (최소~!)

        i. Twin의 amniocentesis 시: Indigo carmine

           1. 처음 뽑은 amniotic sac 을 표시하는 것! (바늘 빼기 전에 주입)

           2. 두번째 뽑은 양수가 파랗게 나오면 같은 amniotic sac 을 뽑은 것이지.

        ii. Marternal cell contamination 확인법?

            XX, XY 확인 시! (즉, 여아이면 확인 불가능)

            Constitutional chimerism 가능성도 있지만 매우 드물기 때문에 XX, XY 확인시 marternal conta. 로 생각.

   C. (20주 이후, 본원은 거의 출생시) Cordocentesis (제대혈 채혈) / 태아 손실률 2~3% (but, 빠른 결과 72hrs 배양)

        i.  Maternal cell contamination, MCC 확인 법? HbF 의 존재로 확인

            1. by HPLC & capillary EP (위탁) (cord blood: HbF > 90%, adult: HbF < 1%)

            2. by Acid elution test (Kleihauer-Betke test) (SMC 시행): HbF가 acid 에 more resistant 해서 pink

 

4.    양수 검사 방법

   A.     Specimen: Aseptic 하게 syringe 2~3개에 담겨서 도착. (노랗고 투명, 최소 10ml, 보통 20ml)

   B.     Culture: ‘Aseptic!!’ d/t long term culture

        i.         Flask culture / in-situ culture (@ SMC, 배양이 비교적 빨리 진행 됨.)

            1.     In-situ culture: Cover slip 위에 attach 시켜 culture 하고 그 상태 그대로 harvesting 하는 것.

            2.     Flask culture: Flask 벽면에 attach 시켜 culture 하고 긁어내서 harvesting 하는 것.

	장점	단점
In-situ culture	Colony 별 판독 가능 (for mosaicism) Rapid culture (7~10일)
Flask culture	배양 cell 수가 많음	Colony 별로 판독이 안되어 mosaicism 해석이 어렵다. (true vs. pseudo) 배양 시간이 길다. (2~3주)

            3.      양수를 conical tube에 옮겨 담고 centrifuge 하여 cell 을 모은다. (상층액은 보통 chemistry로~)

            4.      모은 cell 에 media (BIO-AMF, 부착세포 전용배지)를 넣고 mix.

            5.      Dish 위에 cover slip 을 놓고 media 에 부유시킨 cell 을 seeding한다.

                      A.     보통 7개의 dish를 만든다. (A: 3개, B: 3개, B/U: 1개)

            6.      최소 2개의 배양계: 반드시 배양기 2대에 서로 나누어 incubating

                      A.     검체를 다시 채취하는 것이 어렵고 long-term culture 이므로, 배양기 오염 등의 위험에 대비.

            7.      24hrs 경과 후 media 첨가

            8.      6일 경과 후 attach 여부 관찰

                      A.     (bad) media 절반만 교체

                      B.      (good) media 모두 교체

            9.      이후부터 daily로 attach 여부 확인하여 harvesting time 결정.

                      A.     1 dish 에 50개 이상의 round cell 이 존재하는 colony가 3개 이상일 때 harvest!

                      B.      Colony: 한 cell 에서 분화되어 생성된 세포군

                      C.     In-situ Harvest (Thermotron 후드 안에서 진행. 30도, 53%)

                             i.         EtBr 및 colcemid 함께 넣어 추가 incubation

                             ii.         Hypotonic solution (Na-citrate)

                             iii.         Fixation (30도, 75%); Carnoy’s fixative

                             iv.         Spreading: suction 기법! (suction 천천히 하면 spreading 증가; 기화 속도가 늦어서)

                             v.         Cover slip 을 슬라이드 위에 mounting. à Colony count 가능하다는 장점!

                      D.     G-banding stain

 

5.    Mosaicism: 한 개체 안에 같은 zygote로부터 기인한 2개 이상의 cell line (karyotype) 이 존재하는 것.

**Chimerism

-      Constituitional chimerism: 한 개체 안에 다른 zygote로부터 기인한 2개 이상의 cell line 이 존재.

       XX, XY 가 있어야 의심할 수 있는데, 이조차도 매우 드문 것. (거의 없다고 보면 됨.)

-      Secondary chimerism: alloBMT 를 받은 환자에서 본인의 cell line과 donor의 cell line 이 함께 존재하는 것.

       (대부분의 chimerism)

   A.     True mosaicism(~0.3%)

           실제로 태아에 존재하는 mosaicism.

           발생시, 수정란의 mitosis 과정에서 non-dysjunction 혹은 chromosome breakage 가 원인.

   B.     Pseudo mosaicism (~4%)

           실제로 태아에는 존재하지 않는 mosaicism.

           흔한 원인은 모세포의 오염, 배양과정에서 생긴 in vitro artifact.

           양수검사보다 융모막생검에서 흔함. 태어난 태아는 정상!

   Ø  감별법: 보통은 20개의 metaphase 를 분석하지만 mosaicism 이 의심되면 additional metaphase 를 분석한다                                   (extensive; 24개 더/moderate; 12개 더).

                     대략적으로, 2개 이상의 배양계 or colony 에서 같은 mosaicism 이 동시에 나타나면

                     true 일 가능성이 높고, 단 1개의 배양계 or colony 에서만 확인되면 pseudo의 가능성이 높다.

 

6.    CPM, confined placental mosaicism: Placenta 에 한정된 cytogenetic abnormality.

     i.         CVS (융모생검)의 1~2% 에서 확인 됨.

               90%의 태아는 정상이고 10%의 태아는 같은 abnormality 확인 됨. 확인하려면 양수천자해서 f/u.

     ii.         보통 Trisomy가 확인됨.

         1.     16 (m/c), 2, 3, 7, 8

         2.     Sex chromosome 은 영향이 적음.

     iii.         (기전-1) Mitotic CPM: mitotic non-dysjunction in trophoblast

                  (비태아세포에서 일어나는 유사분열 error; 비분리현상)

     iv.         (기전-2) Meiotic CPM: trisomy 수정란이 trisomy rescue mechanism

                  (post-zygomatic loss of the extra chromosome)에 의해 태아는 정상

                  (UPD가 될 가능성은 있음.)이 되었지만 placenta 에는 trisomy가 남아 있음.

     v.         Type of CPM

          1.     Type-1: cytotrophoblast 에만  

          2.     Type-2: chorionic stroma (inner cell mass; chorionic villus) 에만

          3.     Type-3: both

태반과 배아의 구조.

 

     vi.        (임상적 의의)

                 대부분은 정상 출산! placental dysfunction 에 의해 유산 및 IUGR의 가능성이 상대적으로 높음 

                 (성장하면서 catch-up 한다면 placenta 가 원인이라는 뜻!).

                 Trisomy rescue 의 결과로 UPD가 된 경우, 간혹 태어난 태아가 정상 karyotype 이지만 발달 지연 가능.

 

7.    Maternal Serum Screening (Prenatal screening- non invasive)

   A.     NIPT (10주~); Non-invasive Prenatal Testing

   B.     Integrated test (1st + 2nd trimester test 종합하여 판독)

      i.         1st trimester (Combined) test (10~13주)

           1.     PAPP-A

           2.     Free b-hCG

           3.     초음파 NT (nuchal translucency): DS, ES은 투명대 증가

      ii.         2nd trimester (Quadruple) test (15~22주): hCG, AFP, inhibin, UE3

           1.     AFP

           2.     hCG

           3.     uE3: unconjugated estriol

           4.     inhibin A

	NT(US)	PAPP-A	AFP	uE3	hCG	Inhibin
+21 (DS)	↑	↓	↓	↓	↑	↑
+18 (ES)	↑	↓	↓	↓	↓	↓
NTDs	Spina bifida	normal	↑	normal	normal	normal

 

8.    자연 유산

   A.     15% 가 자연 유산 됨. (그 중 80%는 in 1st trimester)

   B.     45, X 의 95% 는 자연 유산 됨. (1st trimester 유산의 10%)

   C.     자연 유산의 60%는 염색체 이상. (그 중 52%는 autosomal trisomy)

 

9.    임신중절 (낙태죄 헌법불합치: 2021.01.01부로 임신중절이 범죄는 아님. 낙태법 개정은 아직.)

   A.     14주 이내: 조건 없이 원하면 가능.

   B.     14-24주: 모자보건법에 명시된 조건 때만 가능.

      i.         우생학적, 유전학적 정신장애, 신체질환

           1.     우생학적 또는 유전학적 정신장애나 신체질환은 연골무형성증, 낭성섬유증 및 그 밖의 유전성 질환으로서

                   그  질환이 태아에 미치는 위험성이 높은 질환

      ii.         부모의 전염성 질환

           1.     풍진, 톡소플라즈마증 및 그 밖에 의학적으로 태아에 미치는 위험성이 높은 전염성 질환

      iii.         강간, 준강간에 의한 임신

      iv.         혈족간 임신

      v.         임신의 지속이 모체의 건강을 해칠 우려가 있을 때.  

   C.     24주 이상: 불법.