혈액종양질환의 염색체 검사

[Hematology]

 

Acquired chromosomal abnormality

- 출생 시 정상이었으나, 질병의 발생으로 후천적으로 획득한 염색체 이상.

 

Oncogenesis

   ①.   Proto-oncogene (genes that promote cell cycle progression)의 gain

   ②.   Tumor suppressor gene (regulatory gene)의 loss

           Ex) Loss of TP53 (del 17p)

   ③.   새로운 fusion gene 의 생성 → oncogenesis 유발

           Translocation in somatic mutation: exon + exon의 결합으로 새로운 fusion gene 이 생김.

             - PML/RARA fusion gene; der(15); RARa receptor 결함으로 retinoic acid signaling arrest

             - BCR/ABL1 fusion gene; der(22); ABL1 gene (proto-oncogene)의 overexpression.

                                                                    → Tyrosine kinase signaling always on 

             - CBFB/MYH11 fusion gene; inv(16): Core binding factor (전사인자)의 결함. → Regulatory error.

             - IGH-(  ) fusion gene: der(14), IGH gene 옆에 붙은 유전자가 overexpression 됨.

           Cf) Translocation in constitutional mutation: 주로 intron 에서 break 되어 phenotype 은 정상.

 

혈액종양질환에서 관찰되는 다양한 Fusion gene, Fusion protein

 

 

1.     혈액종양에서 염색체 검사의 유용성 / 적응증: 진단, 예후, 치료효과 판정

   A.     진단

      i.         CML: t(9;22)(q34;q11.2); der(22)가 Ph(BCR/ABL1) gene; proto-oncogene ABL1의 overexpression.

          1.         BCR on ch 22, ABL1 on ch 9

          2.         Tyrosine kinase signaling 의 조절 실패. (always on) à TKI 를 치료제로 사용.

      ii.         AML: 아래 3개의 variant 가 있으면 blast <20% 라도 AML 진단 가능.

          1.     AML1/ETO (RUNX1/RUNX1T1); t(8;21)(q22;q22)

          2.     PML/RARA; t(15;17)(q24;q21); der(15), PML/RARA fusion gene

          3.     CBFB/MYH11; inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22)

      iii.         MDS: dysplasia 없고 cytopenia 만 있는 경우, 아래 variant 있으면 MDS-U.

                  “MDS-defining abnormality”,    는 t-MDS related! del(20q), +8 은 예외~~

          1.     del(5q) or -5, del(7q) or -7, del(9q), del(11q), del(12p), del(13q) or -13

          2.     i(17q)

          3.     idic(X)(q13)

          4.     t(11;16), t(3;21), t(1;3), t(2;11), inv(3) or t(3;3), t(6;9)

 

   B.      예후 → 치료에 반영

AML	Favor: high dose CTx.
	inv(16), t(16;16)(p13.1;q22); CBFB/MYH11 t(8;21); AML1/ETO (RUNX1/RUNX1T1) t(15;17); PML/RARA biallelic CEBPA mutation mutated NPM1 without FLT-ITD
	Poor: consider alloBMT
	t(v;11q23.3); KMT2A rearrangement (* t(9;11); KMT2A-MLLT3: intermediate) t(6;9)(p23;q34.1); DEK-NUP214 t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 inv(3)(q21.3q26.2), t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM del(5q), -5 del(7q), -7 Complex karyotype Wild-type NPM1 with high allelic FLT3-ITD
CML	Poor (related to transformation to AP or BP)
	extra Ph gene i(17q) +8 +19
MDS	Very good
	-Y del(11q)
	Good
	Normal del(5q), double including del(5q) del(12p) del(20q)
	Poor
	-7, double including -7 or del(7q) (* del(7q) only: intermediate) inv(3) or t(3;3), del(3q) Complex

 

   C.     치료효과 / BMT 생착 여부 판정 (f/u): initial clone 의 존재 여부 및 proportion 으로 response 판단.

      i.         CML, with hematologic / cytogenetic / molecular response (최소 20개의 metaphase)

                (Complete: <1%, Partial: 1~35% / Minor: 35~65% / No response: >65%)

                → TKI agent 12개월에도 CR 도달하지 않으면 2세대 TKI or 증량.

 

2.    Procedure (Flask 법; floating cell)

   A.     Culture

      i.         RPMI 배지 + NCBS + sample (+ mitogen)

           1.     PHA, phytohemagglutinin (T), TPA, tetradecanol phorbol acetate (B), CpG ODN (CLL)

                A.     Mitotic index 가 낮은 mature lymphoid neoplasm 에만 mitogen 필요함.

                B.      Mitotic index 가 높은 acute leukemia, Burkitt lymphoma, 및 solid tumor 들은 mitogen 필요 없음.

      ii.           Sample 의 양은? 세포 수 106/ml 가 배양에 가장 적절한 밀도.

           1.       BM 은 sample quality 및 cellularity 가 제각각이므로, cell count 를 해서 sample 양 정함.

                A.      Sample에 RBC lysis solution 넣고 WBC 카운트 한다. (>5 cells/square by 뉴바우어 챔버)

      iii.         Incubation: 37도, 5% CO2 incubator

           1.       mitogen 넣은 것은 72 hrs / no mitogen 은 24 hrs (proliferation 잘하니까~)

 

   B.      Harvest

      i.         EtBr 은 넣지 않음. (breakage 위험 있음)

      ii.         Colcemid (spindle poison)

      iii.         Hypotonic (KCL)

   C.     Fixation : Carnoy’s fixative

   D.     Spreading: 습도를 높이면 spreading 이 더 잘됨.

   E.      Stain: Trypsin + Giemsa stain (G-banding)

 

3.    결과 판독

   A.      BM: 비정상인 metaphase 위주로 reading (400 resolution)

   B.      Resolution: 10 q21 이 1개로 보이면 400 / 2개로 보이면 550

   C.     20개의 metaphase를 모두 count & analyze 하는 이유?

           1) 혈액질환에서 chromosome study가 abnormal clone을 detect 할 수 있는 sensitivity 를 고려하여 정함.

                (by ACMG guideline),

           2) sideline 존재 가능성.

           Cf) PB 는 20 metaphase 를 count, 5 metaphase 를 analyze 한다.

                 (numerical abnormal에 대한 mosaicism 만 확인하면 되니까)

“Analyze 20 metaphase cells and/or a sufficient number of cells to characterize all abnormal clones and subclones.” – Ref) Genet Med. 2016;18(6):643-648.

   D.     Karyogram: 2 stemline, 1 sideline, 1 normal / 모두 normal이면 2 normal

 

4.    Nomenclature

   A.     Clone, Clonal evolution

      i.         Clone: 하나의 progenitor cell 로부터 기인한 cell population

           1.     Gain / rearrangement: 2개 이상

           2.     Loss: 3개 이상 (2개까지는 Random loss의 가능성이 있다고 봄.)

      ii.         Clonal evolution: Primary clone (stemline)에서 이차적으로/추가로 clone (sideline)이 발생한 경우.

      iii.         Chromosome 외에 clone을 정의할 수 있는 방법?

           1.     FISH

           2.     RT-PCR

           3.     Phenotype: Morphology, Immunophenotyping

                  (B cell에서 kappa/lambda restriction, T cell에서 CD2,3,5,7 aberration 및 TRBC1 expression 등)

   B.      Mainline, Stemline, Sideline

      i.         Mainline (ml): ‘the most frequent’ clone (양적 개념)

      ii.         Stemline (sl): ‘the most basic’ clone (제일 먼저 표기)

      iii.         Sideline (sdl): stemline 에서 파생된 모든 subclone (stemline의 변이를 포함)

   C.     idem: ‘same’, 앞서 기술한 stemline 이 그대로 존재한다는 의미.

   D.     Modal number: haploid, diploid, triploid, tetraploid

      i.         Haploid: one set of chromosome (n)

      ii.         Diploid: two set of chromosome (2n)

           1.     Hypodiploidy: 46 – 11

           2.     Hyperdiploidy: 46 + 11

      iii.         Euploidy: 염색체 개수가 23의 배수 (diploidy, triploidy, tetraploidy..)

      iv.         Aneuploidy: 염색체 개수가 23의 배수가 아닌 경우

   E.      Composite karyotype (cp)

      i.         Clone 의 정의는 만족하나 각 세포들이 heterogeneous 한 경우.

      ii.         Clonal aberration에 cell-to-cell variation이 있어 sl, sdl을 결정할 수 없는 경우.

                  → 적어도 2개 이상의 cell에서 관찰되는 모든 clonal abnormality를 표기한다.

   F.      Complex karyotype: 3개 이상의 aberrancy 가 존재하는 핵형.(예후가 나쁨)