형광제자리 부합법. FISH (FIuorescence in situ hybridization)

[Molecular cytogenetics]

 

FISH; fluorescence in-situ hybridization (형광제자리부합법)

출처: Frontiers

 

1.     원리: 세포 유전학에 분자 유전학적 기법을 접목한 것.

                 Interphase 혹은 metaphase 에서 target gene 에 대한 특정 probe 를 hybridization 시킨 후

                 형광 signal 을 관찰하여 numerical 이상 혹은 structural rearrangement 여부를 확인. 

   A.     FICTION method (ImmunoFISH): MM FISH

            FICTION = Fluorescence Immunophenotyping and interphase Cytogenetics as a Tool

                              for the Investigation Of Neoplasms, Combined immunophenotyping and FISH.

       i.         MM 에서는 clonal plasma cell 외에도 정상세포 비율이 높다. 따라서 clonal plasma cell 을 구분하기 위해                            Kappa/Lambda immunostain 과 FISH 를 함께 시행함.

                  => cytoplasmic kappa/lambda stain 을 해야하므로 세포막을 터뜨려서 spreading 시키면 안됨.

                  => Harvest 과정에서 높은 곳에서 spreading 시키는 과정을 하지 않고 살짝 떨어뜨림.

                       따라서 metaphase 관찰은 불가능.

 

2.     Metaphase FISH / Interphase FISH

   A.     Metaphase FISH: 특정 유전자의 염색체 내 위치를 확인.

                                       (미세결실증후군의 진단 혹은 marker chromosome 이 있는 complex karyotype 에서

                                       target 유전자의 유무를 확인 가능.)

       i.         Microdeletion syndromes (500kb ~ 5Mb) *5Mb 이상은 chromosome 에서 보임.

            1.     PWS / AS: del15q

                A.      Genomic imprinting: PWS (아버지의 15q 결실) / AS (어머니의 15q 결실)

                B.       Uniparental disomy: PWS (어머니의 15q UPD) / AS (아버지의 15q UPD)

            2.     DiGeorge symdrome (CATCH22): del22q

            3.     Williams syndrome: del7q

            4.     Miller-Dieker syndrome(17p13.3) / Smith-Magenis syndrome(17p11.2): del17p

       ii.         Scoring cell number

            1.     At least, 10 metaphases

            2.     For mosaicism, at least, 50 metaphases

   B.      Interphase FISH: clonal cell 의 genetic abnormality 여부를 확인. (혈액 종양의 진단 및 f/u)

       i.         Scoring cell number

            1.     At least, 200 interphases 가 기본 원칙.

            2.     For mosaicism (or chimerism BMT X/Y): at least, 500 interphases

            3.     For nonmosaic congenital, at least 50 interphases (microdeletion 같은 것)

 

3.     Process

   A.      Probe denaturation: DW + Protease buffer로 전처리. (Vysis probe 만, metasystem 및 cytocell 은 생략)

   B.      Slide making & pretreatment: pellet 을 harvest 과정과 동일하게 slide making

       i.         Pallet 으로 harvesting 한 slide 로 하는 것이 기본이지만 pallet 이 모자라면 asp. slide로 시행.

                  asp. 로 하면 이미 죽은 cell 이므로 metaphase FISH 관찰은 불가능

       ii.         Asp. Slide 로 할 때는 RBC lysis 추가해야 함. (by Carnoy’s fixative)

       iii.        준비한 slide 를 Protease / SSC(Saline sodium citrate)로 37도에서 전처리; probe 가 잘 침투하도록 돕는 과정.

       iv.         Probe 를 올리고 커버글라스 덮고 rubber cement 로 sealing.

   C.     Slide denaturation: DNA double strand -> single strand (75도, by Hybrite)

   D.     Hybridization: Probe 붙이기 (37도에서 overnight, rubber cement 로 sealing 하여 습도 유지)

   E.      Counter stain: DAPI stain; 핵을 파랗게 염색해 줌. 구조를 확인하여 판독을 도움.  

   F.      형광관찰, Image capture (정상 1개, 비정상 2개)

 

4.     장점/단점

장점	단점
Conventional chromosome 보다 민감도가 높아 작은 유전자 변이 확인 가능. (cryptic 확인 가능) Chromosome: 2 ~ 10 Mb Metaphase FISH: 1~3Mb Interphase FISH: 100kb~2Mb **CMA: 50 ~ 100 Kb 검사 시간이 짦음 (세포배양이나 DNA 추출 불필요) 모든 주기의 cell 로 가능.	Point mutation 확인 불가능 Target gene 에 대해서만 확인 가능.

 

5.     FISH probe 의 종류 (Target 위치로 분류)

   A.     Locus(sequence) specific probe (LSI): 유전자 특이 서열에 결합하는 probe (ex. Translocation 확인)

   B.     Satellite sequence probe (centromere probe): heterochromatin 에 결합하는 probe.

           염색체 수적 이상을 확인. (aneuploidy 확인 용)

   C.     Whole chromosome paints probe: 전체 chromosome 에 도포되는 probe.

           복잡한 수적/구조적 이상에 도움이 되지만 하나의 염색체 내에서 일어나는 이상은 알 수 없음.

   D.     Telomere probe

 

6.     FISH probe 의 종류 (Design 형태로 분류)

   A.      Single color probe (SC): 1 target, control probe 없음.

      i.         딱 해당 부위의 deletion 만 확인 가능.

      ii.         Rb1(13q14.2), CEP X, Yq12, CEPY, CEP8, CEP12, CEP4, CEP10, CEP17

   B.      Dual color deletion (DC): 1 target, 1 control probe  

      i.         해당 염색체 전체 혹은 넓은 부위의 deletion 도 확인 가능.

      ii.         EGR1(5q31)/5p15.2, D7S522(7q31)/CEP7, TP53(17p13)/CEP17 등.

   C.      Dual color single fusion(SF): 2 targets, Break point 가 probe 밖에 있도록 설계되어 rearrangement시

                                                          probe 전체가 이동. Normal 은 2R2G, Abnormal은 1R1G1F.

                                                          3차원 내의 위상차 때문에 위양성률이 높음.

       i.         현재 쓰고 있는 probe 없음.

   D.     Dual color extra signal (ES): 2 targets, 하나의 probe 는 break point 를 포함하고 있어서

                                                            SF 의 위양성률을 다소 낮춤. Normal은 2R2G, Abnormal은 1R2G1F.

       i.         현재 쓰고 있는 probe는 ETV6/RUNX1 (TEL/AML1) 뿐!

   E.      Dual color dual fusion (DF): 2 targets, 두 probe 모두 break point 를 포함하고 있어서

                                                             balanced translocation 일 때, 2 fusion 확인 가능. 위양성률 가장 낮춤.

                                                             Normal은 2R2G, Abnormal은 1R1G2F. Best!! (대부분의 fusion probe)

   F.      Break apart (BA) probe: 해당 유전자가 다양한 partner gene과 rearrangement 를 일으키는 경우에 유용.                                                         한 유전자의 5’ 및 3’에 서로 다른 형광을 붙여서 signal split 을 관찰

       i.         Normal: 2 F / Abnormal: 1R1G1F 등

       ii.         IGH(14q32), MLL(11q23), MYC(8q24), BCL6(3q27), BCL2(18q21.33), ALK(2q23), RARA(17q21) 등.

 

7.     FISH probe validation

- FISH probe 신규 도입 시 시행한다.

- FISH probe 는 대부분 non-waived test 이므로 새로운 probe 를 검사실에 도입할 때 validation부터 시작한다.

Validation: 식약처 (미국은 FDA) 승인을 받지 않은 (non-waived test) 검사 혹은 modified test 인 경우,

                  검사의 신뢰성을 처음부터 확인하는 과정을 거쳐야 하고, 이를 validation 이라 한다.

                  (보통 양성검체가 포함된 20개 이상의 검체를 준비해야 함)

Verification: 식약처 승인된 검사의 경우, 제조사에서 제공하는 validation 자료를

                     검사실 자체에서 검증하는 과정만 거치고 사용할 수 있는데, 이를 verification 이라 한다.

*** FISH 는 대부분 non-waived test 이므로 새로운 probe 를 도입할 때, validation 과정이 필요하다.

*** Validation 항목들

     - Probe Localization

     - Sensitivity/Specificity (Probe, Analytical, Clinical)

     - Normal cut-off

     - Precision, Accuracy

     - Interference & Cross-reactivity 

 

   A.     Probe localization

       i.         Probe 가 target 에 정확히 hybridization 하는지 확인 하는 것.

                  (cross-hybridization or contamination probe 여부를 확인)

       ii.         적어도 5명의 남성 검체로 5개 이상의 metaphase 확인. (SMC 지침서에는 10 metaphase)

   B.      Probe sensitivity & specificity

       i.         Probe sensitivity: intended target 에 적절히 결합한 probe / total intended target 수 (>95%)

                  = 전체 target 중에 실제로 결합한 probe 의 비율

       ii.         Probe specificity: intended target 에 적절히 결합한 probe / positive signal (>98% ACMG, >95% ECA)

                  = 양성 signal 중 찐 양성의 비율

       iii.         적어도 5명의 남성 검체로 > 100 metaphases (for sex ch. > 200 metaphases) (by CLSI)

       iv.         Interphase 로 확인한다면, 500 interphase 로!

                   (예상 신호수보다 실제 신호 수가 적으면 sensitivity 가 감소함을,

                    실제 신호 수가 많으면 specificity 가 감소함을 의미한다.)

   C.     Precision

       i.         Intra-assay(같은 날짜) & Inter-assay (다른 날짜): 정상 1개, 비정상 1개로 consistency 확인 (<5%)

   D.     Normal Cut-off

       i.         음성/양성을 구분할 수 있는 기준값= 통계적으로 정상인의 95%를 음성으로 판독할 수 있는 값.

       ii.         실제 정규분포를 이룰 정도로 많은 검체를 검사할 수 없으니,

                   한정된 검체로 cut-off 를 산출할 수 있는 통계 함수를 이용.

                   = Beta-inversion / mean + confidence interval / maximum likelihood 중 선택.

       iii.         For acquired or mosaicism) at least, 각각 200 nuclei from 20 명의 정상인 검체

       iv.         For non-mosaic constitutional; microdeletion) at least, 50 nuclei from 20 명의 정상인 검체로 충분

                   - At least, 각각 200 nuclei from 30 명의 정상인 검체 or 500 nuclei from 20 명 (Interphase FISH)

                   - 각 positive pattern별로 maximum # of false positive 를 beta-inversion 함수에 넣어 산출.

                      = Cut-off 가 높은 경향이 있어 false-positive 가 낮은 방법.

                   - Probe 마다, Abnormality마다, cut-off 다르지만 대략, DF 0.6%, ES 1.0%, BA 2.5%, DC 3.5%, SF 10% 정도.

  

8.     QC monitoring: 매 FISH 검사 시행 시 모니터링 해야하며, probe 마다 최소 연 2회 이상 기록해야 한다.

   A.     부합효율 (Hybridization efficiency): 충분한 형광강도를 보이면서 잘 hybridize 된 세포의 %를 구하여

                                                                    90% 이상인지 확인한다. (정확하게 signal 개수를 셀 수 있는 cell 의 분율)

   B.      형광강도 (Probe signal intensity): signal 의 강도가 적절하고 일관성 있는 세포의 %를 구하여

                                                                   90% 이상인지 확인한다.

   C.     Control 에서 expected negative pattern 이 잘 나오는지 확인한다.

       i.         FISH negative control

           1.     주로 internal control 을 활용

               A.     Deletion 을 보는 SC 면, normal homolog 의 signal 이 control 이 됨.

               B.     Deletion 을 보는 DC 면, normal homolog 의 signal 과 함께 같은 chromosome 내의

                        target 과 다른 위치에 internal control loci 를 확인. (TP53/CEP17, EGR1/D5S23…)

               C.     Fusion probe의 경우, normal homolog 상의 probe signal 이 internal control 이 된다.

           2.     Internal control이 없으면(ex. Y probe in female), external control (정상 남자)로 parallel test

   D.     Verification of new LOT probe

       i.         모든 probe 는 Lot 번호나 shipment 가 변경되었을 때, 기존 probe와의 비교 검증이 필요하다.

                  기존 probe 로 검사를 시행한 환자 검체 중, 음성 / 양성 각각 1개를 이용하여 Lot 간 consistency 를 확인.                              음성/양성 여부 일치 및 양성의 경우 5% 이내의 차이를 보여야 acceptable 하다.

   E.      FISH reference check

       i.         6개월마다, Lot 변경시, 정상 검체로 cut-off 이내에 드는지 확인하고 기록해두어야 함. 

 

< FISH Profile >

MDS/AML	ALL
TP53 (DC) MLL (BA) Chromosome 5q (DC) Chromosome 7q (DC)	CEP4/10/17 (TC) TP53 (DC) MLL (BA) ETV6/RUNX1 (ES) – cALL 만
MM	Double hit
IGH/MAF, MAF, FGFR3, CCND1 (DF) TP53 (DC) Chromosome 1q (DC) Chromosome 13q (DC)	MYC (BA) BCL2 (BA) BCL6 (BA)