Fungus AST, 항진균제 약제감수성 검사

Terminology

AST = Antibiotic / Antifungal susceptibility test = 항균제/항진균제 감수성 검사

Antibiogram – Overall profile of AST results of a specific microbial species

Breakpoint – MIC (minimal inhibitory concentration) or Zone diameter value used for interpretive category (S/I/R)

Interpretive category – Category derived from microbiological characteristics, PK-PD parameters, and clinical outcome data

#. S (Susceptible): MIC at or below / zone diameter at or above the susceptible breakpoint are inhibited by the usually achievable plasma concentrations of antimicrobial agent

#. SDD (Susceptible-dose dependent): Susceptibility of an isolate is dependent on the dosing regimen. Maximal approved dosage regimen should be considered, since higher exposure gives the highest probability of adequate coverage of an SDD isolate

→ Intermediate category에 포함되나, susceptible breakpoint보다 높은 용량을 사용했을 때 감수성을 보인다는 임상적 증거가 있을 때 SDD 설정 가능.

#. I (Intermediate): Response rates may be lower than for susceptible isolates.

#. R (Resistant): MIC at or above / zone diameters at or below the resistant breakpoint are not inhibited by the usually achievable plasma concentrations of the antimicrobial agent

MIC – The lowest concentration of an antimicrobial agent that causes a specified reduction in visible growth of a microorganism in an agar or broth dilution susceptibility test

Epidemiological cutoff value (ECV) – MIC or zone diameter value that seperates microbial populations into those with and without acquired acquired/mutational resistance based on their phenotypes (wild-type or non-wild type).

→ ECV는 (모집단을 통계적으로 대표할 수 있는) 표본집단의 상위 97.5 percentile MIC 값으로 설정한다.

→ Breakpoint를 설정하기 어려운 진균과 항진균제의 경우에 ECV를 사용하여 내성/감수성을 판단

Trailing

- Incomplete growth inhibition

- Reduced but persistent growth over an extended concentration range that increases with incubation time

→ Candida spp. 중 특히 C. albicans와 C. tropicalis가 fluconazole, voriconazole에 대해 trailing growth를 보이고, in vivo에서는 susceptible함에도 불구하고, resistant 해 보이게 만든다

→ Pseudo-resistance

 

 

Yeast (효모균) AST

-      혈액과 CSF에서 분리된 효모균에 대해 항진균제 감수성 검사를 시행하고, 다른 검체(urine 등)에서 분리된 효모균은 요구가 있을 경우 AST를 진행한다.

-      항진균제가 첨가된 시험관의 균주 성장 정도를 항진균제가 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 판독한다.

-      정도관리 균주: Candida parapsilosis ATCC 22019

 

배양 조건

배지: RPMI 1640 (pH 7.0 ± 0.1, 25℃)

항진균제: AST 검사 위해 농도별로 준비 / 불수용성 항진균제는 DMSO를 이용하여 용해

 

배양 시간 (VITEK-2 AST-YS08 card 기준)

-      Candida spp: BMD reading at 24hr  (EUCAST, CLSI)

-      Cryptococcus neoformans: BMD reading at 48hr  (EUCAST, CLSI)

 

AST Procedure

시험균주는 SDA/PDA 배지에서 35℃에서 계대배양하고 (Candida spp.는 24hr, C. neoformans는 48hr) 집락을 따서 0.5 McFarland standard (1x10^6 ~ 5x10^6 cells/mL)에 맞추고, RPMI 1640으로 1:100, 1:20 희석을 순차적으로 시행하여 working suspension (5x10^2 ~ 2.5x10^3 cells/mL)을 만든다.

Macrodilution: 항진균제 0.1mL에 inoculum 0.9mL를 접종하고, 35℃에서 24~48hr (Candida spp.) / 70~74hr (Cryptococcus neoformans) 후 결과를 판독한다.

Microdilution: 항진균제와 시험균주로 만든 working suspension을 1:1로 혼합하여 결과를 판독한다.

 

판독 기준 (End point 법)

항진균제 감수성 검사 판독 기준.

-      Amphotericin B의 경우, “score 0”을 보이는 가장 낮은 약물 농도

-      Flucytosine, azoles, echinocandins은 “score 2”를 보이는 가장 낮은 약물 농도

 

 

Mould (사상균) AST

판독 기준 (End point 법)

항진균제 감수성 검사 판독 기준.

-      Amphotericin B의 경우, “score 0”을 보이는 가장 낮은 약물 농도

-      Flucytosine, Fluconazole, Ketoconazole의 경우,

       #. Non-dermatophyte는 “score 2”를 보이는 가장 낮은 약물 농도

       #. Dermatophyte는 > 80% reduction (score 1?)을 보이는 가장 낮은 약물 농도

-      Itraconazole, Posaconazole, Voriconazole, Isavuconazole의 경우,

       #. Non-dermatophyte는 “score 0”을 보이는 가장 낮은 약물 농도

       #. Dermatophyte는 >80% reduction (score 1?)을 보이는 가장 낮은 약물 농도

-      Echinocandins (Anidulafungin, Caspofungin, Micafungin)의 경우,

       Endpoint가 명확하게 정의되지 않아, MIC가 아닌 MEC (Minimal Effective Concentration)을 적용한다.

       MEC란, 항진균제 처리 후 Growth control well의 왕성한 hyphal growth와 비교했을 때,

       small, rounded, and compact hyphal form이 형성되는 최소 농도를 의미한다.

Ref)

CLSI M27 ED4:2017,          Broth dilution AST of Yeasts

CLSI M27M44S-ED3:2022, Performance standards for AST of Yeasts

CLSI M38-ED3:2017,           Broth dilution AST of Filamentous Fungi