결핵균 배양, 염색, 약제 감수성검사

전처리

2% NaOH-NALC (N-acetyl-L-cysteine) 처리 → Vortex mixing (점액질 풀어지도록 섞어준다)

→ 실온 방치, 20분 (오염균 제거) → 침전물에 DW 더하여 50mL로 만들기

→ 3000g 20분 원심분리 → 상층액 버리고 침전물 획득

 

NaOH: 오염균 제거 작용 / NALC: 객담 점액을 녹이는 작용

 

 

Slide 도말 및 배지 접종

침전물에 MGIT supplement 800uL 첨가 → 액체배지에 500uL 접종 → 고체배지에 100uL 접종, Slide에 나머지

 

 

항산성염색 도말 검사. AFB stain

염색법

1.     Fluorescence method (형광 염색)

Auramine O-Rhodamine 시약, 5분 → Fluorescence Decolorizer, 1분 → Methylene Blue, 1분

 

2.     Ziehl-Neelsen’s method : 형광 염색법으로 양성이 확인된 슬라이드검사에 적용

Carbol-fuchsin 가온 염색, 5분 → 3% HCl-Alcohol으로 탈색, 3분 → Methylene Blue, 1~2분

 

염색 판독

검경된 항산균수 (Fuchsin Stain) (1000Ｘ 배율)	검경된 항산균수 (Fluorochrome) (450Ｘ 배율)	보      고
0  /  300 HPF	0  /  70 LPF	No AFB Seen
1~2  /  300 HPF	1~2  /  70 LPF	Trace
1~9  /  100 HPF	2~18  /  50 LPF	1+
1~9  /  10 HPF	4~36  /  10 LPF	2+
1~9  /  1 HPF	4~36  /  1 LPF	3+
>9  /  1 HPF	>36  /  1 LPF	4+

 

 

항산균 배양 검사. Mycobacterium Culture

항산균 배양은 Mycobacterium를 확진하는데 필수적이나 시간이 오래 걸림.

폐결핵 의심 환자에서 도말 양성인 경우에도, 반드시 배양 검사를 1회 이상, 도말 음성인 경우에는 2회 이상의 배양 검사를 시행해야 함.

 

고체 배지: Ogawa 배지

- 집락의 육안 관찰이 용이하고 오염률이 낮다

- 배양 온도: 35~37도 / 30도 (검체가 skin swab, soft tissue, pus 등인 경우, M. chelnoae, M. abscessus, M. fortuitum, M. haemophilium, M. marinum, M. ulcerans 등 감염을 고려) / 42도(M. xenopi 의심 시)

- 6주간 배양하면서 1주일마다 판독

 

액체 배지: Middle brook 7H9을 기반으로 한 상품화된 전용 배지, MGIT 960

- 고체배양에 비해 빠른 시간 안에 검출할 수 있다는 장점 (MTB 9~14일, NTM ~7일)

- 집락 모양을 관찰할 수 없고 기타 세균에 의한 오염률이 상대적으로 높다.

- 결핵균은 산소를 소모하므로, 배지 속 산소 양에 반응하는 형광 indicator로 결핵균 검출 여부를 알 수 있음

  매 60분마다 형광 측정하여 판독

- BACTEC MGIT 960 System에 넣어 37℃에서 6주간 배양

 

 

항산균 약제 감수성 검사. Mycobacterium DST

검사 과정

1.     액체배지 혹은 고체 배지 집략으로부터 DST 접종액 및 균액(=접종액과 식염수, 1:100 희석액)을 만든다.

2.     약제 및 Supplement를 분주한다.

3.     5개의 MGIT tube를 만든다. - Growth control(GC), RIF(0.5), RIF(1.0), INH, PNB

4.     각 tube에 균액을 접종한다.

5.     BACTEC MGIT 960 System에 넣어 배양한다.

 

검사 판독

- GC tube의 Growth unit 값이 400에 도달하면 약제가 들어간 다른 tube의 Growth unit 값과 비교 분석

- 약제 들어간 tube의 Growth unit < 100: Susceptible (S)

- 약제 들어간 tube의 Growth unit ≥ 100: Resistant (R)

- Invalid result

    ⊙ Code 0200: GC 이 400 GU까지 충분히 자라지 않은 경우

    ⊙ Code 0400: 접종량 과다 또는 오염 (M. chelonae, M. fortuitum 같은 신속발육 NTM 균이 자란경우)

 

P-NITROBENZOIC ACID (PNB) test

MGIT GC tube 의 Growth Unit 값이 400에 도달하였을 때, PNB tube의 Growth Unit 값이 ≤100 이면 Mycobacterium tuberculosis complex 로 해석한다.

- PNB tube Growth Unit >100 => Non tuberculous Mycobacteria (NTM)

- PNB tube Growth Unit ≤100 => Mycobacterium tuberculosis complex

 

약제 감수성 검사 대상:  결핵 배양 양성 환자 중 “신환”이거나 “6개월 내(접수일 기준)에 DST 결과 없는 경우”