임상화학 검사의 기본 원리 - 분광광도법

A. Spectrophotometer(분광광도계)의 이해

1) Beer-Lambert law

- A = abc = log(100/%T) = 2 –log(%T) = -log(T)

- 측정물질의 농도는 흡수된 빛의 양(흡광도)에 비례하고 투과량(투과도)에 반비례한다.

- 흡광도 (A, Absorbance)

- 투과도 (T, Transmittence) = P/P0, 백분율 투과도 (%T)

- 몰흡광계수(a, epsilon): 물질 고유의 값

- Beer’s law: 화학종의 몰농도(c)와 흡광도(A)가 비례 / Lambert’s law: 통과해야하는 길이(b)와 흡광도(A)가 비례

 

* Beer’s law 조건

- 입사광이 단색 방사광이어야 함

- 용질의 흡광도에 비해 용매에 의한 빛의 흡수를 무시할 수 있어야 함

- 용질의 농도가 직선성을 보장할 수 있는 일정 범위 내에 있어야 함.

- 광학적 간섭이 없어야 함

- 측정하고자 하는 물질과 다른 물질 사이에 화학적 작용이 일어나지 않아야 함

 

2) Spectrophotometer의 구성요소

분광광도계는 광원, 파장선택장치, 검체 용기, 광 검출기, 신호처리기, 출력장치 총 6개 부분으로 이루어진다.

- 광원: continuum source(연속형)(주로 사용됨, 텅스텐-가시광선, 듀테리움-자외선, 제논-양쪽 모두),

line source(선형)(원자방사광원, 수은/나트륨 증기 전구, 레이저 광원)

- 파장선택장치: 필터, 프리즘, 격자 단색기(grating monochromator), 홀로그램 격자. 단일파장선으로 만들어줌.

- 검체 용기(Cuvette): 분광광도계의 빛이 통과하는 경로 상에 분석하고자 하는 액체 검체를 담아 두기 위한 작은용기이다. 파장에 따라 용기 재질 달라짐.

무수 규산(fused silica)/석영(quartz)큐벳 – 350nm 이하의 자외선,

규산염 유리 – 350~2,000 nm 파장 광선,

플라스틱 용기 – 가시광선, 보통 가로, 세로 1cm

- 광 검출기: 광감수성 표면에 타격된 광자의 수에 비례하여 빛을 전기 신호로 바꾸어 주는 장치이다.

Ex) 광증폭관(photomultiplier tube, PMT), photovoltaic/barrier layer cell, 진공 광관(vacuum phototubes), 실리콘 다이오드 변환기(silicon diode transducers), 다채널 광자 변환기(multichannel photon transducers)

- 신호처리기 및 출력장치: 변환기 신호 처리하여 출력장치로 출력

 

3) Spectrophotometer의 광원 종류

- 중수소방전관, 수소램프: 220~360nm

- 텅스텐-필라멘트램프: 360~950nm

- 텅스텐-요오드램프: 가시광선, 근자외선(near-UV)영역

- 제논램프: 자외선, 가시광선

- 수은-증기램프: 강한 불연속스펙트럼(313, 365, 405, 436, 546), 형광광도계의 광원으로 사용

* 단광로식과 복광로식

- 단광로: 한 개의 광로로 비색하는 방식

- 복광로: 동일 광원으로부터 나오는 빛을 이분하여, 한쪽의 광로에 맹검용 액층(셀), 다른 쪽의 광로에 시료 액층을 설치하여 흡광도를 측정하는 방식 -> 고정밀도 요구 분석에 적합

- 광원 세기 변동에 의한 오차 보정 -> 안정성 상승

- 0%(흡광도), 100%T(투과도)에 맞추는 조정을 한번만 하면 됨

- 흡광도의 시간에 따른 변화 연속측정 가능

 

B. Kinetic assay and End point assay의 이해

1) 효소법

- 측정대상이 되는 물질을 기질로 생각하고 이것에 특이적으로 작용하는 효소를 작용시켜서 생성된 생성물을 측정함으로써 기질을 정량하는 방법

- 종말점법(end-point assay)

충분한 시간을 두고 효소를 작용시켜 완전히 평형에 도달한 상태에서 생성물을 측정하면 그 양은 본래의 기질농도와 비례, 좋은 정밀도, 맹검 검사 필요.

종말점법보다 평형법이 더 정확한 표현. 기질이 완전히 산물로 전환되는 유형의 반응에서 (E+S -> E+P) 가장 정확하게 사용할 수 있다. 물론 효소의 양을 늘리면 기질의 대부분이 산물로 전환되고 반응 시간(배양 시간)도 단축시킬 수 있다.

- 반응속도법(kinetic assay)

기질농도가 낮을 때 반응속도는 기질농도에 비례하기 때문에 반응률을 연속계측법으로 구하여 기질농도를 산출(미카엘리스-멘텐식), 기질농도가 Km의 0.2배 이하일 때 사용, 정밀도 낮음, 맹검 불필요 (V=Vmax/Km *[S])

- Km: 초기속도가 Vmax의 1/2일 때 이에 해당하는 기질의 농도

 

	End-point	Kinetic
조작	반응시작 후 일정시간 경과한 다음 반응 정지시키고 생성물/기질 측정	반응시작 후 반응속도 일정해지면 흡광도의 변화로부터 생성물량 측정
분석법	표준물질 이용한 상대적 분석	표준물질 불필요, 절대적 분석
측정기기	일반 Spectrophotometer	온도제어장치 + 자동 Spectrophotometer
활성치 계산	검량선으로 계산	물흡광계수로 구함
장점	다량의 검체 한번에 측정	단시간
Ex)	AST의 Reitman-Frankel법	AST의 Karmen(UV)법

 

 

C. 과 내에 있는 화학 분석기의 분석 원리 작성 – 일반화학 검사지침서 참고하기

1) Roche cobas c702 : 자동 생화학검사 분석 장비

- Total protein - Biuret 법(protein-Cu2+ 540nm spectrophotometry)

- Albumin – Dye binding-BCG(albumin-BCG + 570nm spectrophotometry)

- Cholesterol - Cholesterol esterase와 Cholesterol oxidase를 차례로 반응시켜 발생한 H2O2를 정색반응으로 측정.

- AST, ALT : UV test (IFCC method)

- Glucose: Hexokinase/G6P-DH측정법 (NADH detection with 340nm)

- BUN: Urease with GLDH(NADH 흡광도 감소 측정)

- Creatinine: Jaffe rate-blanked and compensated (등적색의 creatinine-picric acid complex 정색 측정 – bilirubin 영향 최소화 위해 rate-blanking 사용)

- Uric acid: uricase에 의한 H2O2 생성 후 peroxidase 청자색의 흡광도 측정 (enzymatic colorimetric)

- Ca: NM-BAMPTA assay 흡광도 변화 측정

- P: phosphomolybdate – UV법

- Direct bilirubin: Diazo Malloy-Evelyn method (azobilirubin 적색)

2) Roche cobas e801 : 자동 면역검사 분석 장비

3) 나머지 중요한 장비들

Beckman DxI800: Testosterone, PTH, PHI / CLIA(화학발색면역효소법)

Nova CRT8+: iCa / ISE

Roche AVL 9181: iCa, Li / ISE(ion selective electrode)

Osmometer(FISKE 2400): freezing point osmometry

NEO-BIL plus: neonate T.bil / capillary photometry

Tosoh G11/Bio-rad Variant II Turbo: HbA1c / HPLC

Roche cobas U601: routine urinalysis

Sysmex UF-5000: urine microscopy, flow cytometry

 

D. 기기의 maintenance 지침 이해

- 기기마다 일일점검, 주간점검, 월간점검

 

E. 개별 검사종목 측정 원리 파악과 방법의 이해

C 항목 참조.

 

F. IFCC method 이해

- IFCC method란, 37도에서 enzyme의 catalytic activity concentration을 측정하는 reference procedure이며, CK, LDH, AST/ALT, GGT 농도를 측정하는데에 활용된다. 측정 원리는 340nm에서 NADH의 흡광도 감소 정도를 측정함으로써 해당 효소 농도를 간접적으로 알 수 있다.

- 1: reference procedures for the measurement of catalytic activity concentration of enzymes at 37C

- 2: Creatinine Kinase / 3: LDH / 4: ALT / 5: AST / 6: r-Glutamyltransferase / 7: Certification of 2~6

 

 

Reference)

진단검사의학 제6판

Special Thanks to S.H.Yu M.D.